Projeto - 404644 - Titulação de anticorpos neutralizantes anti-toxinas A e B de Clostridium difficile em soros de porcas e leitões vacinados com uma vacina experimental
Clostridium difficile destaca-se como um importante causador de diarreia em seres humanos e animais. Apesar dessa conhecida importânci, até o momento, existe apenas uma vacina comercial para prevenção e controle da infecção por C. difficile em suinos. Não há, porém, nenhum trabalho publicado demonstrando a potencia desse imunógeno, permanecendo a dúvida quanto a sua eficácia. Nesse contexto, a equipe do Laboratório de Anaeróbios da Escola de Veterinária da UFMG desenvolveu uma vacina recombinante baseada em epitopos dominantes das toxinas A/B. O referido imunógeno foi testado inicialmente testado em coelhos, comprovando sua imunogencidade e permitindo a seleção de uma dose adequada para estudo na espécie-alvo. Em sequência, foi compravada sua imunogenecidade em suínos, incluindo a transferêmcia de anticorpos para leitões neonatos via colostro de porcas imunizadas. A próxima etapa do presente estudo é avaliar o soro das porcas e leitões quanto a presença de anticorpos neutralizantes.
Objetivo geral:
Titular anticorpos neutralizantes anti-toxinas A e B de Clostridium difficile em soros de porcas e leitões vacinados com uma vacina experimental
Objetivos específicos:
Objetivos
Titular antitoxinas A e B de Clostridium difficile em soros de porcas e leitões
Metodologia:
Para titulação de anticorpos neutralizantes, serão utilizados soros de dois grupos de sete porcas (n=14). O grupo imunizado (n=7) foi imunizado 60 e 30 dias antes do parto, por via subcutânea. Soro sanguíneo desses animais foi coletado no dia das vacinações e entre 24 e 72 horas após o parto. O grupo controle (n=7) recebeu salina 0,9% estéril com adjuvante hidróxido de alumínio (ARTIUSHIN et al., 2013; SALVARANI et al., 2013). Após o parto, os leitões de cada matriz foram submetidos a colostragem assistida (OLIVEIRA JÚNIOR et al., 2019a; SALVARANI et al., 2013). Entre 24 e 72 horas após o parto, coletou-se soro sanguineo de pelo menos sete leitões, amostrados aleatoriamente em cada leitegada, para a detecção e titulação de anticorpos por soroneutralização das toxinas A e B em células (SALVARANI et al., 2013; TIAN et al., 2012; 2017).
Células Vero cultivadas em meio DMEM suplementado com soro fetal bovino (Sigma, USA) (1 x 105 células/poço) serão incubadas em placas de cultivo celular de 96 poços por 24 h a 37 ºC (BABCOCK et al., 2006; HUSSACK et al., 2011; ROBERTS et al., 2012; TIAN et al., 2012). Toxinas A e B nativas de C. difficile serão produzidas no Laboratório de Bacterioses e Pesquisa da Escola de Veterinária da UFMG. Será utilizada a maior diluição de toxinas A/B responsável pela indução de efeito citotóxico em 100% das células Vero após incubação prévia com 0,1 UI de soro anti-toxina de Clostridium sordellii (HUSSACK et al., 2011; ORTH et al., 2014). Os soros testes serão incubados por 1 h com diferentes diluições na base 2, iniciando com 1:10 (TIAN et al., 2017), seguido de adição, em duplicata, aos poços com cultivo de células Vero e incubação por 24 h (HUSSACK et al., 2012; TIAN et al., 2012). O maior título de anticorpos neutralizantes responsáveis pela inibição do efeito citopático em 100% das células Vero cultivadas será determinado por microscopia óptica e considerado como título do soro em questão (ECP/mL) (DONALD et al., 2013; TIAN et al., 2012).
A homoscedasticidade e normalidade dos dados referentes aos títulos de anticorpos neutralizantes de suínos serão avaliados com os testes F e Shapiro-Wilks, respectivamente. Dados com distribuição normal e condições de homoscedasticidade serão analisados com o Teste T Não Pareado. As análises serão realizadas com o auxílio do software InfoStat.
Indicadores de avaliação:
Relatórios a serem realizados em paralelo com a empresa proponente
